Alaninbildung in Zymomonas mobilis durch Expression des Alanindehydrogenase-Gens aus Bacillus-Stämmen

Uhlenbusch, I.

Book/Report

FZJ-2018-03290

Alaninbildung in Zymomonas mobilis durch Expression des Alanindehydrogenase-Gens aus Bacillus-Stämmen

Uhlenbusch, I. (Corresponding author)FZJ*

1990
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag, Berichte des Forschungszentrums Jülich 2370, 118 p. (1990)

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/18775

Report No.: Juel-2370

Abstract: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Stoffwechselfluß des ethanolproduzierenden Bakteriums $\textit{Z. mobilis}$ durch Einführung eines L-Alanindehydrogenasegens ($\textit{ala}$D-Gen) in Richtung L-Alaninbildung umzulenken. 1. Es wurden verschiedene Vektoren für $\textit{Z. mobilis}$ konstruiert,durch die das $\textit{ala}$D-Gen mit Hilfe des Zymomonaseigenen Pyruvatdecarboxylase-Promotors ($\textit{pdc}$-Promotor) transkribiert wurde. Als $\textit{ala}$D-Gen wurde zunächst das Gen aus dem thermophilen $\textit{Bacillus}$-Stamm $\textit{B.stearothermophilus}$ verwendet. Im Laufe der Arbeit wurde außerdem ein $\textit{ala}$D-Gen aus dem mesophilen Stamm $\textit{B.sphaericus}$ kloniert ($\textit{ala}$Dsp), das besser zur Alaninbildung in $\textit{Z.mobilis}$ geeignet war. Dieses Gen führte auf dem Vektor pZY 73 zu einer Alanindehydrogenase-Aktivität (Ala-DH-Aktivität) von etwa 1 U/mg Protein in dem $\textit{Z.mobilis}$-Stamm CP4. In $\textit{E.coli}$/pZY 73 Transformanden betrug die Ala-DH-Aktivität etwa 11 U/mg Protein. 2. Die Aktivität der thiaminpyrophosphatabhängigen Pyruvatdecarboxylase (PDC), des Konkurrenzenzyms der Ala-DH um das gemeinsame Substrat Pyruvat, wurde durch die Verwendung einer thiaminauxotrophen Mutante CP4-thi verringert. Die Mutante konnte ohne Thiaminzusatz im Medium kein Thiaminpyrophosphat mehr synthetisieren . Die PDC-Aktivität wurde durch 16 h Kultivierung unter Thiaminmangel von 3,2 U/mg Trockengewicht auf 0,8 U/mg Trockengewicht gesenkt. Von CP4-thi/pZY 73-Zellen wurden in 26 h nach einer 20-stündigen Inkubation unter Thiaminmangel 84 mM Alanin in Medium mit 5 % Glukose und 100 mM Ammonium ausgeschieden. 3. Durch Anpassung der Kultivierungsbedingungen an die Aminierungsreaktion der Ala-DH konnte die Alaninausscheidung der transkonjuganten $\textit{Z.mobilis}$-Stämme gegenüber Kultivierungen in herkömmlichen Mineralsalzmedien auf das 6-20-fache gesteigert werden. So schied CP4/pZY 73 bei 30$^\circ$C in Mineralsalzmedium pH 5,5 mit 5 % Glukose und 15 mM Ammoniumsulfat 10 mM Alanin aus, bei 37 $^\circ$C in Mineralsalzmedium pH 7,0 mit 5 % Glukose, 15 mM Ammoniumsulfat und 85 mMAmmoniumacetat waren es 64 mM, wobei der L-Alaninanteil 97 % betrug. 4. Durch Ermittlung interner und externer Kaliumkonzentrationen konnte gezeigt werden, daß die Cytoplasmamembran während der Alaninbildungsphase intakt war. Nach Bestimmung der internen und externen Aminosäurekonzentrationen und derCytoplasmavolumina in transkonjuganten Stämmen zeigte sich weiterhin, daß Alanin über einen Carrier-vermittelten Transport, der vom Alaninkonzentrationsgradienten getrieben wird, sekretiert wird.V

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